2. Les protéines adaptatrices

   Comme mentionné précédemment, les facteurs de croissance activent une autre famille de « second messager » appelée protéines adaptatrices. Les protéines adaptatrices sont des protéines qui ont la particularité de ne pas posséder d'activité enzymatique. Cependant ces protéines jouent un rôle très important dans la signalisation cellulaire. Ces adaptateurs possèdent des domaines consensus (SH2, SH3, PH, PTB…) nécessaires aux interactions protéine/protéine et à la transduction du signal. Leurs différents domaines d'interaction protéine/protéine permettent de moduler positivement (Introduction, § 2.1.) ou négativement (Introduction, § 2.2.) la transduction du signal.

   2.1. Protéines adaptatrices régulateurs positifs de la signalisation

   Les premiers exemples de protéines adaptatrices identifiées furent les régulateurs de la croissance cellulaire induite par les facteurs de croissance ou par les oncogènes. Les premières protéines adaptatrices isolées furent Grb2 (Clark et coll., 1992 ; Lowenstein et coll., 1992) (Introduction, § 2.1.1.), puis la protéine Shc (Pellicci et coll., 1992) qui devient phosphorylée en tyrosine lors de la stimulation de la cellule par les facteurs de croissance. Il y a également les protéines adaptatrices provenant des rétrovirus transformants comme v-Crk (Mayer et coll., 1988). L'oncogène v-Crk fut identifié comme le composant transformant du virus de sarcome aviaire CT10 (Mayer et coll., 1988). Il possède un domaine SH3 qui interagit avec les facteurs d'échange du nucléotide GTP, Sos et C3G, ce qui conduit à l'activation des petites protéines GTPasique de la superfamille Ras (Birge et coll., 1996).

  Ces protéines ont toutes un rôle positif dans la transduction du signal. L'exemple des protéines Grb2 et Nck, qui ont été très largement étudiées, permet de comprendre par quels mécanismes, les adaptateurs régulent positivement les voies de signalisation dans lesquelles ils interviennent.

      2.1.1. Grb2 et l'activation de la protéine Ras

   Grb2 est sans doute la protéine adaptatrice la mieux caractérisée. Elle est composée d'un domaine SH2 entouré de deux domaines SH3 (Figure 2.1.). Cette structure lui permet d'interagir avec des protéines contenant une phosphotyrosine via son domaine SH2 et des protéines contenant des régions riches en proline via ses domaines SH3. Grb2 peut se lier avec les sites d'autophosphorylation des récepteurs aux facteurs de croissance soit directement soit par l'intermédiaire d'une autre protéine adaptatrice phosphorylée en tyrosine comme Shc ou de la phosphatase SHP-2. Shc est un adaptateur, contenant un domaine SH2 et un domaine ayant aussi une affinité pour les séquences peptidiques phosphorylées en tyrosine appelé phospotyrosine binding domain (PTB), qui se trouve phosphorylé en tyrosine en réponse aux facteurs de croissance comme le PDGF, ce qui crée un site de liaison pour Grb2 (Pelici et coll., 1992). La phosphatase SHP-2 (Syp, PTP1D ou SHPTP2) est une protéine possédant deux domaines SH2 et devient phosphorylée en tyrosine en réponse au PDGF (Li et coll., 1994).

   D'autres membres de la famille Grb2 ont été isolés : Grap et Gads qui semblent posséder un domaine SH2 ayant la même spécificité de liaison que celui de Grb2 mais des domaines SH3 qui ont des effecteurs différents de celui de Grb2 (Liu et McGlade, 1998).

  Grb2 se trouve associée de façon constitutive via ses domaines SH3 avec Sos, le facteur d'échange de la petite protéine GTPasique Ras. Ce complexe Grb2/Sos va se lier au site d'autophosphorylation du récepteur aux facteurs de croissance, par exemple le récepteur à l'EGF, activé par son ligand (Buday et Downward, 1993 ; Chardin et coll., 1993 ; Egan et coll., 1993 ; Gale et coll., 1993 ; Rozakis-Adcock et coll., 1993). Ce complexe ainsi localisé à la membrane, permet à Sos de catalyser l'échange entre la forme Ras liée au GDP (Ras inactif) et la forme Ras liée au GTP (Ras actif). La protéine Ras-GTP s'associe à plusieurs effecteurs dont la sérine/thréonine kinase Raf, la PI3-K, Ras-GAP ou encore Ral-GDS dont l'incidence n'est pas encore clairement définie (Joneson et Bar-Sagi, 1997). En réponse aux facteurs de croissance, la protéine Ras-GTP active alors la voie mitogen-activated protein (MAP) kinase et la signalisation jusqu'au noyau. Cette cascade d'événements induit la réponse cellulaire : prolifération ou différenciation de la cellule (Figure 2.2.).

      2.1.2. Nck, la prolifération et la différenciation cellulaire

   La protéine Nck possède trois domaines SH3 et un domaine SH2 (Figure 2.1.) (Lehmann et coll., 1990). Un second membre de la famille Nck a été récemment isolé : Nckb ou Grb4 qui possède 68% d'identité avec Nck (Chen et coll., 1998 ; Braverman et Quilliam, 1999). L'adaptateur Nck s'associe via son domaine SH2 avec les récepteurs à l'EGF et au PDGF activés (Li et coll., 1992 ; Park et Rhee, 1992), ainsi qu'avec des protéines intracellulaires phosphorylées en tyrosine comme Src (Chou et coll., 1992) et IRS-1 (Lee et coll., 1993). La stimulation des cellules par les facteurs de croissance entraîne la phosphorylation des résidus tyrosine (Tyr), thréonine (Thr) et sérine (Ser) de Nck (Li et coll., 1992 ; Meisenhelder et Hunter, 1992 ; Park et coll., 1992).

   Nck joue un rôle dans la prolifération cellulaire : sa surexpression induit la transformation des fibroblastes murins (Chou et coll., 1992 ; Lee et coll., 1992). Des études suggèrent que Nck puisse contribuer à l'activation de Ras : (i) Nck peut se lier à Sos, le facteur d'échange GDP/GTP de Ras via ses domaines SH3 (Hu et coll., 1995) et d'autre part, (ii) Nck peut réguler la transcription du promoteur de Fos, promoteur dépendant de la voie de signalisation de Ras, via son interaction avec Sos (Figure 2.2.) (Hu et coll., 1995). Il a été également montré que Nck contribuerait à l'activation de la mitogenèse induite par le PDGF (Roche et coll., 1996). Dans les cellules PC12, il a été montré que la surexpression de Nck bloquait la croissance des neurites induite par le NGF et le bFGF, ce qui indique un effet inhibiteur de Nck sur la voie de différenciation dépendante de la voie Ras (Rockow et coll., 1996).

   La stimulation par le PDGF permet également la translocation de kinases associées à Nck tels que PAK1, PAK3 et PRK2 dont l'activité enzymatique est stimulée par association avec les membres des petites protéines GTPasiques de la famille Rho (Tanaka et coll., 1995 ; Bokoch et coll., 1996 ; Lu et coll., 1997). La translocation de ces kinases entraîne l'activation des cascades de signalisation JNK et SAPK2 (p38 MAP kinase) qui conduisent à une réponse proliférative (Figure 2.2.).

   2.2. Protéines adaptatrices régulateurs négatifs de la signalisation

   Récemment, une nouvelle famille de protéines adaptatrices, à laquelle Slap appartient, qui possède un rôle inhibiteur de la réponse cellulaire a été identifiée. Le premier exemple de cette nouvelle famille fut la protéine CIS (Yoshimura et coll., 1995) qui a été découverte lors de la recherche de nouveaux gènes activés par les cytokines (Introduction, § 2.2.1.). Depuis, de nombreuses autres protéines avec des propriétés semblables ont été identifiées. Parmi elles, la protéine Smad intervenant dans la signalisation du TGFb (Heldin et coll., 1997), les protéines apparentées à CIS (la famille SOCS, JAB ou SSI) (Starr et coll., 1997 ; Endo et coll., 1997 ; Naka et coll., 1997), Cbl (Ota et Samelson, 1997), APS (Yokouchi et coll., 1999), FRNK (Richardson et Parsons, 1996), Grb3-3 (Fath et coll., 1994), Grb14 (Kasus-Jacobi et coll., 1998) et Slap (Roche et coll., 1998) (Tableau 2.1.).

   L'exemple des protéines de la famille SOCS, de la protéine FRNK et de Slap permet de comprendre quels sont les différents mécanismes utilisés par ces protéines adaptatrices pour réguler négativement la transduction du signal.

      2.2.1. Inhibition de Jak par les adaptateurs SOCS

   Les protéines tyrosine kinases cytoplasmiques de la famille Janus kinase (Jak) sont des régulateurs importants de la réponse biologique des cellules du système immunitaire et hématopoïétique induite par les cytokines. La protéine Jak est associée de façon constitutive avec les récepteurs aux cytokines et la liaison de ces récepteurs avec leurs ligands entraîne la phosphorylation en tyrosine de Jak. Dans la réponse aux cytokines, les effecteurs de Jak sont les facteurs de transcription de la famille signal transducer and activator of transcription (STAT). Lors de la stimulation des cellules par les cytokines, les protéines STAT s'associent à une phosphotyrosine au niveau de la partie cytoplasmique du récepteur aux cytokines et deviennent à leur tour phosphorylées en tyrosine par Jak. Cette phosphorylation des protéines STAT va entraîner leur dimérisation et leur translocation au noyau où ces dimères pourront activer leurs gènes cibles (Starr et Hilton, 1999).

   Une approche fonctionnelle a été utilisée par Starr et coll. en 1997 dans le but d'isoler des inhibiteurs de la signalisation des cytokines, ce qui a conduit à l'identification d'une nouvelle famille de protéines, la famille supressor of cytokine signaling (SOCS). La famille SOCS comprend au moins 8 membres (SOCS1-7 et CIS) (Starr et Hilton, 1999). Tous ces membres possèdent une région N-terminale variable, un domaine SH2 central homologue au domaine SH2 de STAT et une séquence d'environ 40 acides aminés conservée entre les différents membres et qui définit un nouveau domaine appelé « SOCS box » (Figure 2.1.). Ce nouveau domaine est également présent dans plusieurs protéines non apparentées à la famille SOCS (WSB-1 et 2 ; RAR et RAR-like ; ASB-1 à 3 ; SSB-1 à 3), et qui pourraient avoir des fonctions dans la stabilité et la localisation protéique pour certaines et pour d'autres, des fonctions sans rapport avec la transduction du signal (Hilton et coll., 1998). Les adaptateurs SOCS inhibent les fonctions des enzymes Jak de 2 façons : soit en inhibant l'activité kinase de Jak (SOCS-1/JAB/SSI-1) (Starr et coll., 1997 ; Endo et coll., 1997 ; Naka et coll., 1997), soit en empêchant l'association et la phosphorylation de STAT par Jak, par compétition avec le site de liaison de STAT sur le récepteur (CIS) (Figure 2.3.) (Starr et Hilton, 1999).

   SOCS-1 interagit avec la phosphotyrosine située dans la boucle d'activation du domaine catalytique de Jak2, empêchant ainsi l'activation du domaine kinase à la fois in vitro et in vivo (Figure 2.3.) (Yasukawa et coll., 1999). SOCS-1 est activé au niveau transcriptionnel par STAT lui-même. Il pourrait s'agir d'une boucle de rétrocontrôle négatif puisque la transcription de SOCS-1 est activée quelques minutes après stimulation par les cytokines (Yasukawa et coll., 1999). La surexpression de SOCS-1 inhibe la signalisation de nombreuses cytokines, ce qui permet de penser que cette protéine joue un rôle central dans la voie de signalisation de Jak/STAT. Ainsi SOCS-1 affecte la signalisation des cytokines suivantes : l'oncostatine M, la thrombopoïetine, les facteurs de croissance, le leukaemia inhibitory factor (LIF) et IL-6 (Starr et Hilton, 1999). Cette fonction vient récemment d'être confirmée in vivo à partir d'études de recombinaisons homologues chez la souris : ces résultats montrent clairement un rôle important de SOCS-1 dans la régulation négative des cytokines tel que l'interféron g, et un rôle de SOCS-3 dans l'erythropoïèse au niveau du foie (Alexander et coll., 1999 ; Marine et coll., 1999 a, b).

   Contrairement à SOCS-1, CIS n'affecte pas l'activité kinase de Jak mais agit en empêchant la phosphorylation de son substrat in vivo (Figure 2.3.). Le domaine SH2 de CIS possède une forte homologie avec le domaine SH2 de STAT et rentre en compétition avec celui-ci pour l'association avec le récepteur aux cytokines, ce qui empêche la translocation à la membrane de STAT et son association avec Jak2. Comme SOCS-1, CIS est activé au niveau transcriptionnel par IL-3 et par l'EPO. Cependant sa cinétique d'activation est différente de celle de SOCS-1 puisque l'expression du gène cis persiste 24 h après l'exposition au ligand (Yoshimura et coll., 1998).

   Ainsi les différents membres de la famille SOCS/CIS pourraient réguler différents aspects de la réponse cellulaire induite par les cytokines. Une combinaison de plusieurs adaptateurs pourrait définir des mécanismes hautement régulés comme la force et la durée de la réponse cellulaire. Cet aspect de la signalisation peut avoir des conséquences extrêmement importantes sur la réponse cellulaire. Par exemple, il a été montré qu'une activation prolongée de la sérine/thréonine MAP kinase pouvait changer une réponse de croissance cellulaire en une réponse de différenciation cellulaire dans le cas des cellules PC12 (Dikic et coll., 1994 ; Traverse et coll., 1994).

      2.2.2. FRNK régulateur négatif de FAK

   La protéine FAK (Introduction, § 1.2.1.5.) est une protéine régulatrice importante de l'adhésion et de la migration cellulaire. Contrairement aux autres sous-familles de protéines tyrosine kinases cytoplasmiques, FAK ne possède aucune homologie de séquence comme les domaines SH2 et SH3. FAK possède deux régions riches en prolines importantes pour les interactions avec les protéines contenant un domaine SH3 et une séquence d'acides aminés appelée focal adhesion targeting (FAT) qui permet l'association avec les foyers d'adhésion (Figure 2.1.) (Parsons, 1996). Bien que le mécanisme d'activation de cette kinase ne soit pas complètement élucidé, il a été montré que l'autophosphorylation en tyrosine de FAK crée un site de liaison pour Src (ou Fyn), ce qui conduit à une stimulation de l'activité de Src qui peut à son tour phosphoryler FAK, ce qui induit son activité catalytique maximale (Parsons, 1996).

   Le produit de l'épissage alternatif du gène fak donne la protéine pp125FAK-related non-kinase (FRNK). Cette protéine adaptatrice est composée du domaine C-terminal non catalytique de FAK et inclut à la fois les régions riches en proline et la séquence FAT (Figure 2.1.). Il a été montré que la surexpression de FRNK inhibait l'activité de FAK in vivo en empêchant la formation de foyers d'adhésion sur fibronectine ainsi que la phosphorylation de ses substrats (Richardson et Parsons, 1996). Le rôle physiologique de la protéine FRNK endogène ainsi que la façon dont elle est régulée ne sont toujours pas connus.

      2.2.3. Slap et la voie de signalisation de Src

   Slap (Src-like adaptor protein) est une protéine adaptatrice qui a été identifiée par criblage double-hybride dans la levure lors de la recherche de nouveaux effecteurs du récepteur tyrosine kinase Eck (Pandey et coll., 1995). Le récepteur Eck est un récepteur de la famille Eph qui est plus particulièrement exprimé dans les tissus du système nerveux (van der Geer et coll., 1994). Slap est une protéine de 35 kDa exprimée de manière ubiquitaire, mais de façon plus abondante dans certains tissus comme les poumons, la rate et le cerveau. Sa principale caractéristique est de posséder des domaines SH2 et SH3 qui ont 50% et 51% d'identité avec ceux de la protéine Src (Figure 2.1.) (Pandey et coll., 1995). Cette protéine possède également un domaine N-terminal de 24 acides aminés, ainsi qu'un domaine C-terminal de 104 acides aminés qui n'ont aucune homologie avec d'autres protéines connues.

   L'homologue humain de la protéine Slap, appelé Src-like adaptor (Sla), ainsi que sa localisation chromosomique ont été déterminés (Angrist et coll., 1995). Le gène humain de Slap se trouve localisé au niveau de l'intron du gène de la thyroglobuline (Meijerink et coll., 1998).

         2.2.3.1. Slap régulateur négatif de la croissance cellulaire

   La surexpression de Slap dans les fibroblastes NIH3T3 s'est avérée toxique puisque aucun clone exprimant de façon stable la protéine Slap n'a pu être obtenu, alors que des transfectants stables exprimant d'autres adaptateurs, comme Grb2 ou Shc, ont pu être générés (Roche et coll., 1998). Pour confirmer que Slap était bien un inhibiteur de croissance cellulaire, une approche de microinjection a été effectuée. Cette étude a montré que Slap inhibait plus de 90% de l'entrée en phase S du cycle cellulaire des cellules stimulées par le PDGF ou par le sérum (Roche et coll., 1998).

   Il a été montré que Slap pouvait s'associer avec le récepteur au PDGF activé sur le même site de liaison que celui de Src, la phosphotyrosine 579 (Roche et coll., 1998). Une étude de liaison compétitive entre les protéines Src et Slap, pour l'interaction avec le récepteur au PDGF, à montré des spécificités de liaison communes entre les domaines SH2 de ces deux protéines (Roche et coll., 1998). De plus il a été montré, toujours dans cette étude, que cette inhibition était dépendante du domaine SH2 et non pas du SH3 de Slap. Il a été également montré que la microinjection d'anticorps spécifiques du domaine C-terminal de Slap, potentialise la réponse à des doses suboptimales de PDGF ou de sérum, ce qui confirme le rôle physiologique de Slap comme inhibiteur de la croissance cellulaire induite par les agents mitogènes (Roche et coll., 1998). Les mécanismes par lesquels Slap inhibe la croissance cellulaire des fibroblastes, stimulée par les facteurs de croissance, sont détaillés au cours de ce travail de thèse (Manes et coll., 1999).

         2.2.3.2. Slap et la différenciation cellulaire

   La croissance et la différenciation cellulaire sont deux phénomènes antagonistes : une cellule doit s'arrêter de proliférer pour se différencier. Les travaux de Ohtsuki et coll., en 1997, ont permis de montrer que la différenciation de la lignée cellulaire U937 en macrophages, par l'acide rétinoïque tout-trans, était accompagnée d'une induction de l'ARNm de Slap. Cela suggère que Slap puisse avoir un rôle dans les processus de différenciation cellulaire.

         2.2.3.3. Slap et la signalisation des récepteurs à antigène des cellules T

   Récemment, une étude menée par Tang et coll. en 1999 a montré que la protéine Cbl pouvait interagir avec Slap dans un système double-hybride dans la levure et in vitro. Il a été également montré que Slap pouvait se lier avec les protéines tyrosine kinases ZAP-70, Syk, la protéine adaptatrice LAT et la chaîne CD3 du récepteur à antigène des cellules T (TCR, T Cell antigen Receptor) via son domaine SH2 lors de l'activation du TCR. Au cours de l'activation du TCR, il y a augmentation de la transcription des gènes des cytokines via le facteur de transcription NFAT. L'expression par transfection de Slap avait un effet positif léger sur l'activité de NFAT, alors que la forme délétée du domaine C-terminal de Slap inhibait cette activité. Toujours selon cette étude, la protéine Slap serait capable de former des homodimères via son domaine C-terminal. De même, la protéine Cbl pourrait interagir avec Slap également au niveau de son domaine C-terminal. Les auteurs pensent que Slap pourrait jouer un rôle dans la signalisation du TCR, peut-être dans la régulation de la kinase Syk. Cependant aucune donnée experimentale ne met en évidence une fonction de Cbl dans la voie intracellulaire régulée par Slap.

   De plus, l'homodimérisation de Slap par interaction directe n'est pas clairement démontrée. En effet, dans leur méthodologie expérimentale, on ne peut pas écarter la possibilité qu'il y ait un ou plusieurs partenaires impliqués dans la formation de l'homodimère. Selon les auteurs, la dimérisation de Slap aurait un rôle dans la régulation du TCR, bien qu'il ne soit pas clairement défini. Cette étude montre que Slap peut interagir avec d'autres adaptateurs comme Cbl, lui même régulateur négatif de la voie de signalisation de Syk.